پیش‌نویس:بررسی اثرجاسمونیک اسید و متیل جاسمونات بر پوسیدگی فیتوفترایی نهال پسته

محمود آخوندی دانش آموخته گروه بیماری شناسی گیاهی، واحد رفسنجان، دانشگاه آزاد اسلامی، رفسنجان، ایران

چکيده

یکی از مهم‌ترین بیماری‌های درختان پسته پوسیدگی طوقه و ریشه (گموز) ناشی از گونه‌های مختلف قارچ Phytophthora می باشد که هرساله باعث از بین رفتن تعداد بسیاري از درختان بارور و غیر بارو می‌شود. مقاومت میزبان یکی از پایدارترین روش های کنترل این بیمارگر است . هدف این تحقیق بررسی تأثیر جاسمونيك اسيد(JA) بر روی پوسیدگی فیتوفترایی ریشه پسته می باشد. در این تحقیق از رقم پسته بادامی ریز زرند جهت کاشت استفاده شد. سپس گياهچه‌هاي یک‌ماهه با غلظت‌هاي 25، 50 ،75و 100 میلی‌گرم جاسمونیک اسید در كيلوگرم خاك مایه‌زنی شده و پس‌ازآن، قارچ(pd) Phytophthora drechsleri روي ريشه نهال‌ها مایه‌زنی گرديد.در اين مطالعه، ميزان فعاليت آنزيم‌هاي كاتالاز، پراكسيداز و فنيل آلانين آمونيالياز اندازه‌گیری شد و نتایج نشان داد که، با افزايش غلظت JA فعاليت ويژه آنزيم كاتالاز (CAT) در مقايسه با شاهد افزايش يافت اما اين افزايش تنها در غلظت 100 ميلي گرم JA در كيلوگرم خاك داراي اختلاف معني دار در سطح 1 درصد با شاهد بود.همچنین نتایج حاصل از داده ها نشان داد در سطح احتمال یک درصد افزایش غلظت اسید جاسمونیک باعث افزایش معنی دار آنزیم گوایکل پراکسیداز در مقایسه با شاهد شده است.علاوه براین، با افزايش غلظت JA فعاليت ويژه آنزيم فنيل آلانين آمونيالياز به طور معني داري در مقايسه با شاهد افزايش يافت. بنابراین محرک اسید جاسمونیک باعث افزایش آنزیم های مقاومت می شود و می توان استفاده از آنها را در کنترل بیولوژیک بیمارگرهای خاکزی پیشنهاد کرد تا از مصرف بی رویه سموم و مقاومت به قارچ کش ها و تخریب محیط زیست تا حدودی جلوگیری شود.

کلمات کلیدی: جاسمونيك اسيد، پوسیدگی فیتوفترایی، پسته

آلودگی گیاهان به عوامل بیماری‌زای گیاهی، سالانه باعث از بین رفتن محصولات کشاورزی و خسارت اقتصادی بسیار زیاد و همچنین وجود زهرابه‌ها در مواد خوراکی که برای انسان و دام مضرند می‌گردد. یکی از این عوامل بیماری زا پوسیدگی طوقه و ریشه ناشی از گونه‌های فیتوفتورا می باشد که هرساله باعث از بین رفتن تعداد زیادی درخت بارور و غیر بارور می‌گردد. چنانچه این قارچ در باغ مستقر شود در طی چند سال باعث از بین رفتن درختان و غیراقتصادی شدن باغ می‌گردد. این بیماری به یکی از چالش‌های باغداران در امر تولید پسته تبدیل‌شده است. پسته یکی از مهم‌ترین محصولات باغی کشور بوده که علاوه بر مصارف داخلی ، نقش عمده‌ای در ارزآوری از طریق صادرات به خارج از کشور دارا هست. بدون شک فقدان آینده‌نگری لازم و برنامه‌ریزی صحیح در مورد این ثروت ملی و منبع درآمدزا، ضربه‌ای مهلک و خطرناک بر پیکره اقتصاد کشور و نیز هزاران باغدار وارد خواهد آورد( داوودی و همکاران 1392 ). بیماری‌های قارچی خصوصاً بیماری پوسیدگی طوقه پسته در بعضی نقاط پسته خیز همچون رفسنجان خسارتی حدود 10 درصد به تولید پسته وارد نموده است (میر ابوالفتحی و همکاران ، 1369). اما ازآنجاکه اين بيماري توسط گونه‌های مختلف قارچ     Phytophthora ایجادشده، می‌تواند در شرايط مساعد باعث مرگ‌ومیر گسترده نهال‌های بارور و غير بارور شود. بیماری پوسیدگی طوقه و ریشه ناشی از گونه‌های فیتوفتورا هرساله باعث از بین رفتن تعداد زیادی درخت بارور و غیر بارور می‌گردد.  كنترل اين بيماري به دليل خاک زاد بودن عامل مولد آن بسيار مشكل و هزینه‌بر می‌باشد. علاوه بر اينكه استفاده از قارچ‌کش‌ها كه نقش اصلي در كنترل اين بيماري را بر عهده‌دارند منجر به آلودگي محیط‌زیست و وجود باقيمانده سموم در محصول پسته توليدي می‌شود. يكي از راه‌های مقابله با عوامل بیماری‌زا در گياهان، فعال نمودن واکنش‌های دفاعي گياه در اثر محرک‌های مختلف مانند متیل جاسمونت، جاسمونيك اسيد و افزايش مقاومت موضعي و سيستميك گياه در مقابل عوامل بیماری‌زا می‌باشد كه به آن مقاومت القايي نيز می‌گویند. استفاده از اين تركيبات می‌تواند منجر به توليد نهال‌های پسته مقاوم به بیماری‌های قارچي ازجمله پوسيدگي فيتوفتورايي ريشه شده كه علاوه بر كاهش هزینه‌های توليد پسته منجر به افزايش توليد محصول سالم پسته و افزايش درآمد حاصل از صادرات اين محصول باارزش گردد. با توجه به مطالب گفته شده هدف این مطالعه بررسی تأثیر متیل جاسمونت و جاسمونيك اسيد بر روی پوسیدگی فیتوفترایی ریشه پسته می باشد.

مواد و روش ها

آماده سازی نهال های پسته

در اين تحقيق از رقم پسته بادامی ریز زرندجهت کاشت استفاده شد. مغزهاي پسته به مدت 30 دقيقه در محلول وايتکس 10 درصد ضدعفوني سطحي شده و سپس سه مرتبه (به مدت ده دقيقه) با آب مقطر سترون شسته شد. پس از خسياندن بذرها به مدت 24 ساعت در آب مقطر سترون و ضدعفوني با قارچ کش‌هاي بنوميل و PCNB (به ميزان 2 در هزار از هركدام قارچكش‌ها)، بذرها لابه لاي پارچه ململ و در ظروف پلاستيكي در دار سترون و در دماي اتاق نگهداري  شد. حدود 10 روز بعد بذرهاي جوانه زده يکنواخت جدا شده و در گلدان هاي يک کيلوگرمي حاوي مخلوطي از ماسه شسته شده و خاک بکر سترون (به نسبت 1:2) کاشته شد.

مایه زنی با متیل جاسمونات و فیتوفترا

گياهچه‌هاي يك ماهه با غلظت‌هاي 25، 50 و75 و100 ميلي گرم متیل جاسمونات در كيلوگرم خاك مايه زني شده و پس از آن، قارچ Phytophthora drechsleri روي ريشه نهال‌ها مايه زني گرديد. تكثير مايه قارچ روي دانه‌هاي گندم استريل انجام شد. براي مايه زني گلدان‎ها، ابتدا مقداري از خاک سطحي گلدان‌ها برداشته شده تا ريشه نهال‌هاي نمايان شوند. براي هر نهال 10 گرم دانه گندم كلنيزه شده در كنار ريشه‌ها ريخته شده و سپس خاک برداشته شده از گلدان‌ها، روي مايه قارچ ريخته شد. با افزودن آب، گلدان‌ها به صورت غرقاب در آمده و يك شب در اين حالت قرار گرفتتند كه پس از آن با ايجاد يك سوراخ کوچک، آب اضافي از ته گلدان‌ها خارج شد. مقداري از اين زه آب براي رديابي زئوسپورهاي قارچ مورد استفاده قرار گرفت(بنی هاشمی،1383).

ارزیابی بیماری

براي ارزيابي ميزان بيماري، پس از برداشت گياه و شستشوي ريشه‌ها، تعداد 40 قطعه يك سانتيمتري از ريشه‌ها به صورت تصادفي جداشده و پس از شستشو با آب، روي محيط كشت CMA-PARP كشت داده شد و با شمارش قطعات كلنيزه شده با قارچ، درصد كلنيزاسيون ريشه‌ها محاسبه گردید. وزن خشك اندام هوايي و ريشه‌ها نيز به صورت جداگانه با استفاده از آون 105 درجه سانتيگراد محاسبه گرديد. در اين آزمايش، ميزان فعاليت آنزيم‌هاي كاتالاز(Aebi, 1984)، پراكسيداز(Polle et al., 1994) و فنيل آلانين آمونيالياز(Zheng et al., 2005) نيز بر اساس منابع موجود اندازه گيري شد.

استخراج پروتئین های ریشه

دو گرم از ریشه ها به صورت تصادفی انتخاب شده و برای استخراج پروتئین ها و اندازه گیری آنزیم های مختلف در دمای ۲۰C- نگهداری شدند. در این تحقیق برای استخراج پروتئین ها از روش Garmendia و همکاران (۲۰۰۴) استفاده شد.

اندازه گیری فعالیت آنزیم ها

فعالیت آنزیم کاتالاز (CAT) در نمونه ها با استفاده از روش  Aebi (1984) و بر اساس سرعت تخریب H2O2 اندازه گیری شد. همچنین برای اندازه گیری فعالیت آنزیم گوایکول پراکسیداز (GPX) از روش Polle و همکاران (۱۹۹۴) استفاده گردید. فعالیت فنیل آلانین آمونیا لیاز (PAL) با استفاده از روش Zheng و همکاران (۲۰۰۵) که در واقع روش تغییر یافته Godwin و همکاران (۱۹۹۶) می باشد اندازه گیری شد.

نتایج

وزن خشك اندام هوايي

با افزايش غلظت جاسمونيك اسيد (JA) وزن خشك اندام هوايي در مقايسه با شاهد افزايش معني داري نشان نداد . مايه زني P. drechsleri (Pd) نيز نتوانست موجب كاهش معني دار وزن خشك اندام هوايي در مقايسه با شاهد شود. در تيمارهاي برهمكنش JA و Pd نيز وزن خشك اندام هوايي در مقايسه با تيمار مايه زني با Pd‌ افزايش نشان داد اما اين افزايش در سطح 1 درصد معني دار نبود. همين روند در غلظت هاي مختلف متيل جاسمونت (MJ) و برهمكنش آن با Pd مشاهده گرديد

تاثير غلظت هاي مختلف جاسمونيك اسيد (JA) و متيل جاسمونت (MJ) و برهمكنش آنها با Phytophthora drechsleri (Pd) بر وزن خشك اندام هوايي نهال هاي پسته بادامي زرند. ستون هايي كه داراي حروف مشترك هستند طبق آزمون دانكن در سطح 1 درصد اختلاف معني داري ندارند.

وزن خشک ریشه نتاج این تحقیق نشان داد که، با افزايش غلظت JA و MJ وزن خشك ريشه در مقايسه با شاهد اختلاف معني داري را نشان نداد. همچنين مايه زني Pd نيز نتوانست موجب كاهش معني دار وزن خشك ريشه شود. در تيمارهاي برهمكنش JA و MJ با Pd نيز وزن خشك ريشه گرچه در مقايسه با تيمار مايه زني با Pd به تنهايي افزايش نشان داد . تاثير غلظت هاي مختلف جاسمونيك اسيد (JA) و متيل جاسمونت (MJ) و برهمكنش آنها با Phytophthora drechsleri (Pd) بر وزن خشك ريشه نهال هاي پسته بادامي زرند. ستون هايي كه داراي حروف مشترك هستند طبق آزمون دانكن در سطح 1 درصد اختلاف معني داري ندارند.

ميزان كلنيزاسيون بيمارگر در ريشه نهال هاي پسته

بر اساس نتایج در تيمارهاي برهمكنش JA و Pd با افزايش غلظت JA ميزان كلنيزاسيون بيمارگر در ريشه نهال هاي پسته بادامي زرند روند كاهشي نشان داد كه اين كاهش در غلظت هاي 50 تا 100 ميلي گرم JA در كيلوگرم خاك داراي اختلاف معني دار در سطح 1 درصد با تيمار مايه زني با Pd به تنهايي بود. كمترين ميزان كلنيزاسيون ريشه در تيمار 100 ميلي گرم JA مشاهده گرديد (شكل 6). برخلاف JA، در كليه تيمارهاي برهمكنش MJ و Pd درصد كلنيزاسيون بيمارگر در ريشه نهال هاي پسته بادامي زرند به طور معني داري در مقايسه با تيمار مايه زني با Pd به تنهايي كاهش يافت كه در غلظت 100 ميلي گرم MJ در كيلوگرم خاك، كمترين درصد كلنيزاسيون ريشه مشاهده گرديد درصد كلنيزاسيون ريشه به وسيله بيمارگر در تيمار برهمكنش غلظت هاي مختلف جاسمونيك اسيد (JA) و متيل جاسمونت (MJ) با Phytophthora drechsleri (Pd) . ستون هايي كه داراي حروف مشترك هستند طبق آزمون دانكن در سطح 1 درصد اختلاف معني­داري ندارند. فعالیت ویژه آنزیم کاتالاز

نتایج نشان داد که، با افزايش غلظت JA فعاليت ويژه آنزيم كاتالاز (CAT) در مقايسه با شاهد افزايش يافت اما اين افزايش تنها در غلظت 100 ميلي گرم JA در كيلوگرم خاك داراي اختلاف معني دار در سطح 1 درصد با شاهد بود مايه زني Pd نيز فعاليت ويژه اين آنزيم را به طور معني داري در مقايسه با شاهد افزايش داد. در تيمارهاي برهمكنش JA و Pd‌ نيز فعاليت ويژه آنزيم كاتالاز در مقايسه با تيمار مايه زني با Pd افزايش يافت كه اين افزايش تنها در غلظت 100 ميلي گرم JA در كيلوگرم خاك اختلاف معني دار در سطح 1 درصد نشان داد. فعاليت ويژه آنزيم كاتالاز در تيمارهاي برهمكنش JA با Pd در مقايسه با تيمارهاي JA به تنهايي به طور معني داري بالاتر بود (شكل 4). مايه زني نهال هاي پسته بادامي زرند با غلظت هاي مختلف MJ موجب افزايش فعاليت ويژه آنزيم كاتالاز گرديد كه اين افزايش فعاليت در غلظت هاي 50 تا 100 ميلي گرم MJ در كيلوگرم خاك داراي اختلاف معني دار با شاهد در سطح 1 درصد بود . فعاليت ويژه آنزيم كاتالاز در تيمار مايه زني با Pd‌ نيز به طور معني داري در مقايسه با شاهد بالاتر بود. در تيمارهاي برهمكنش غلظت هاي 50 تا 100 ميلي گرم MJ در كيلوگرم خاك نيز فعاليت ويژه آنزيم كاتالاز در مقايسه با تيمار مايه زني با Pd به تنهايي به طور معني داري بالاتر بود. همچنين فعاليت ويژه آنزيم كاتالاز در تيمارهاي برهمكنش MJ و Pd به طور معني داري در مقايسه با تيمارهاي مايه زني با MJ به تنهايي بالاتر بود كه اين موضوع تاثير مايه زني بيمارگر بر فعاليت اين آنزيم را نشان مي دهد .تاثير غلظت هاي مختلف جاسمونيك اسيد (JA) و متيل جاسمونت (MJ) و برهمكنش آنها با Phytophthora drechsleri (Pd) بر فعاليت ويژه آنزيم كاتالاز در اندام هوايي نهال هاي پسته بادامي زرند. ستون هايي كه داراي حروف مشترك هستند طبق آزمون دانكن در سطح 1 درصد اختلاف معني داري ندارند.

فعالیت ویژه آنزیم گوایکول پراکسیداز

بر اساس نتایج، با افزايش غلظت JA فعاليت ويژه آنزيم گوايكول پراكسيداز (POD) نيز افزايش يافت كه اين افزايش در غلظت هاي 75 و 100 ميلي گرم JA در كيلوگرم خاك داراي اختلاف معني دار در سطح 1 درصد با شاهد بود (شكل 5). مايه زني Pd نيز موجب افزايش معني دار فعاليت ويژه آنزيم گوايكول پراكسيداز در مقايسه با شاهد گرديد. در تيمارهاي برهمكنش غلظت هاي 50 تا 100 ميلي گرم JA و Pd نيز فعاليت ويژه اين آنزيم در مقايسه با تيمار مايه زني با Pd‌ به تنهايي به طور معني داري بالاتر بود. همچنين فعاليت ويژه آنزيم گوايكول پراكسيداز در تيمارهاي برهمكنش JA و Pd در مقايسه با تيمارهاي مايه زني با JA به تنهايي به طور معني داري بالاتر بوده و اختلاف معني داري را در سطح 1 درصد نشان داد .افزايش غلظت MJ‌ نيز فعاليت ويژه آنزيم گوايكول پراكسيداز را افزايش داد كه اين افزايش در غلظت هاي 50 تا 100 ميلي گرم MJ در كيلوگرم خاك داراي اختلاف معني دار با شاهد بود (شكل 4). مايه زني Pd‌نيز فعاليت ويژه آنزيم گوايكول پراكسيداز را به طور معني داري در مقايسه با شاهد افزايش داد. همچنين با افزايش غلظت MJ، فعاليت ويژه آنزيم گوايكول پراكسيداز در تيمارهاي برهمكنش MJ‌ و Pd در مقايسه با تيمار مايه زني با Pd‌ به تنهايي افزايش يافت علاوه بر اينكه فعاليت ويژه اين آنزيم در تيمارهاي برهمكنش MJ و Pd به طور معني داري در مقايسه با تيمارهاي مايه زني با MJ به تنهايي بالاتر بود .تاثير غلظت هاي مختلف جاسمونيك اسيد (JA) و متيل جاسمونت (MJ) و برهمكنش آنها با Phytophthora drechsleri (Pd) بر فعاليت ويژه آنزيم گوايكول پراكسيداز در اندام هوايي نهال هاي پسته بادامي زرند. ستون هايي كه داراي حروف مشترك هستند طبق آزمون دانكن در سطح 1 درصد اختلاف معني­داري ندارند.

فعاليت ويژه آنزيم فنيل آلانين آمونيالياز

نتایج پژوهش نشان داد که، با افزايش غلظت JA فعاليت ويژه آنزيم فنيل آلانين آمونيالياز به طور معني داري در مقايسه با شاهد افزايش يافت. در تيمار مايه زني با Pd نيز فعاليت ويژه آنزيم فنيل آلانين آمونيالياز در مقايسه با شاهد افزايش يافت (شكل 6). روند افزايش فعاليت ويژه آنزيم فنيل آلانين آمونيالياز در تيمارهاي برهمكنش JA و Pd نيز مشاهده شد كه در اين تيمارها فعاليت ويژه آنزيم در غلظت هاي 75 و 100 ميلي گرم JA در كيلوگرم خاك داراي اختلاف معني دار با تيمار مايه زني با Pd‌ بود. همچنين مقايسه تيمارهاي برهمكنش JA و Pd با تيمارهاي مايه زني با JA به تنهايي نشان داد كه فعاليت ويژه آنزيم فنيل آلانين آمونيالياز در تيمارهاي برهمكنش JA و Pd به طور معني داري بالاتر مي باشد (شكل 6).

تيمارهاي مختلف MJ نيز موجب افزايش فعاليت ويژه آنزيم فنيل آلانين آمونيالياز گرديد كه اين افزايش در غلظت هاي 50 تا 100 ميلي گرم MJ در كيلوگرم خاك به طور معني دار بيشتر از شاهد بود (شكل 6). مايه­زني Pd‌ نيز فعاليت ويژه اين آنزيم را در مقايسه با شاهد به طور معني داري افزايش داد. در تيمارهاي برهمكنش غلظت هاي 50 تا 100 ميلي گرم MJ‌ در كيلوگرم خاك و Pd فعاليت ويژه آنزيم فنيل آلانين آمونيالياز به طور معني داري بالاتر از تيمار مايه زني با Pd به تنهايي بود و بيشترين ميزان فعاليت ويژه اين آنزيم در غلظت هاي 75 و 100 ميلي گرم MJ در كيلوگرم خاك مشاهده گرديد. در تيمارهاي MJ‌ نيز فعاليت ويژه آنزيم فنيل آلانين آمونيالياز در تيمارهاي برهمكنش MJ و Pd به طور معني داري بالاتر از تيمارهاي مايه زني با MJ به تنهايي بود .

بحث و نتیجه‌گیری

هدف پژوهش حاضر بررسی تأثیر متیل جاسمونت و جاسمونیک اسید بر روی پوسیدگی فیتوفترایی ریشه پسته می باشد. در تحقیقات اردستانی و همکاران در بررسی اثر متیل جاسمونات برفعالیت های آنزیم های آنتی اکسیدان نشان داد که تغییرات فعالیت آنزیم کاتالاز در کشت سلولی از روز هفتم به بعد در نمونه های تیمار شده رو به افزایش است. در تحقیق حاضر اثر متیل جاسمونات و فعالیت آنزیم کاتالاز نشان داد که در گیاهان تیمار مایه زنی شده با pd تنها در غلظت 100 میلی گرم متیل جاسمونات برکیلوگرم خاک افزایش معنی داری دارد، که نتایج مطابقت دارد. در تحقیق بروکی و همکاران در سال 1394 در بررسی تاثیر غلظت های مختلف متیل جاسمونات و فعالیت های آنزیم های آنتی اکسیدان نشان داد که بیشترین فعالیت آنزیم PAL و گوایکل پروکسیداز در غلظتهای 1 و 5/0 میلی مولار افزایش پیدا کرده و معنی دار بوده است. نتیجه تحقیق حاضر نشان می دهد که با افزایش غلظت جاسمونیک اسید، افزایش PAL  تنها در غلظت های 75 و 100 میلی گرم در کیلوگرم خاک معنی دار است و در مورد آنزیم گوایکل پروکسیداز این افزایش تنها در غلظت 100 میلیگرم در کیلوگرم خاک است.

گزارشات متعددی وجود دارد که این ترکیب به عنوان سیگنال میزبان برای القاء ISR می باشد و نقش آن به عنوان مولکول سیگنال به اثبات رسیده است . در مجموع دوز پایین برخی ترکیبات فرار خاص می تواند به عنوان مولکول سیگنال روی فنولوژی و بیماری زایی قارچ از یک طرف و دفاع گیاه میزبان از طرف دیگر اثر داشته باشد.  با توجه به متحمل بودن دوزهای پایین در طبیعت به نظر می رسد مکانیسم اصلی بازدارندگی بیمارگر به وسیله ترکیبات فرار به علت ماهیت سیگنالی این ترکیبات در القا مقاومت سیستمیک باشد تا بازداری مستقیم از رشد قارچ بیمارگر.(شریفی و همکاران ،1392).

نتایج بانشی و همکاران در سال 1395 در بررسی القای مقاومت گندم به بیماری پاخوره با کاربرد متیل جاسمونات و چند گونه قارچ مایکوریز نشان داد که غلظت 5/1 میلی مولار متیل جاسمونات در القای مقاومت بیشترین تاثیر را داشته است .(بانشی و همکاران، 1395). نتایج پژوهش های مطلبی و همکاران (2015) نشان داد که کاربرد متیل جاسمونات میزان فنل کل و آنزیم های دفاعی نظیر کاتالاز و پروکسیداز را در گیاه گندم رقم فلات و پیشتاز آلوده به Fusarium culmorrum  افزایش داده است. (Motallehi et al.,2015).که با نتایج تحقیق حاضر در کابرد متیل جاسمونات و اسید جاسمونیک در افزایش آنزیم های مقاومت در بعضی از غلظت ها روی بیمارگر خاکزی فیتوفترا مطابقت دارد. بنابراین محرک اسید جاسمونیک و متیل جاسمونات باعث افزایش آنزیم های مقاومت می شوند. بنابراین می توان استفاده از آنها را در کنترل بیولوژیک بیمارگرهای خاکزی پیشنهاد کرد تا از مصرف بی رویه سموم و مقاومت به قارچ کش ها و تخریب محیط زیست تا حدودی جلوگیری شود.