تعیین کمی پروتئین

تعیین کمی پروتئین ها به طور کلی یک روش رضایت بخش و کامل برای تعیین غلظت هیچ نمونه پروتئینی وجود ندارد . انتخاب یک روش ، وابسته به نوع و ماهیت پروتئین ، ماهیت سایر ترکیبات نمونه پروتئینی ، سرعت مورد لزوم ، دقت و حساسیت آزمایش است .

روش‌های مورد استفاده برای تعیین پروتئین‌ها:

بیوره

• آزمایش بیوره : مکانیسم اندازه گیری پروتئین به روش بیوره تشکیل کمپلکس بین یونهای مس دو ظرفیتی(Cu 2+) و پیوندهای پپتیدی است و برای تشکیل کمپلکس نیاز به حداقل دو پیوند پپتیدی است تا کمپلکس تشکیل گردد که کمپلکس تشکیل شده رنگ بنفش دارد . جذب رنگ آبی تولید شده را در طول موج 540 نانومتر خوانش می کنند و از آنجایی که جذب با غلظت ارتباط مستقیم دارد طبق قانون بییر – لامبرت با رسم یک منحنی استاندارد مقادیر پروتئین مجهول در نمونه قابل اندازه گیری است .

هر چه تعداد پیوند پپتیدی بیشتر باشد شدت و غلظت رنگ بنفش زیادتر خواهد بودعلت تولید رنگ قرار گرفتن مس در بین دو پیوند پپتیدی است .

• آزمایش اثر حلال های آلی : حلال های آلی با تغییر نیروهای آب‌گریز و هیدروژنی، منجر به اختلال در ساختمان های دوم و سوم پروتئین می شود.
• آزمایش اثر فلزات سنگین : در PH حدود 7، بیشتر پروتئین ها دارای بار منفی هستند.بنابراین با یون های فلزات سنگین که دارای بار مثبت هستند، ترکیب شده و نمک های نامحلول این فلزات را تشکیل می دهند که منجر به رسوب پروتئین می گردد.
• آزمایش اثر اسیدها بر پروتئین ها : اسیدهابا تغییر PH و تغییر بار در گروه های آمین و کربوکسیل منجر به شکستن پیوندهای یونی و هیدروژنی در پروتئین ها شده و رسوب میدهند.

تست بیسین چونینیک (BCA)

ویژگی های تست بیسین چونینیک (BCA)

• حساسیت زیاد و سریع ، اگر در دماهای بالا مورد استفاده قرار گیرد .
• سازگار با بسیاری از دترجنت ها
• واکنشگر پایدار
• اختلاف بسیار کم در واکنش با پروتئین های متفاوت
• رنج کاری خطی عریض
• واکنشگر وقتی در دمای اتاق به کار برده می شود ، تمام نمی‌شود .

تست برادفورد (Bradford)

• CBBG اولیه با آرژنین باقی‌مانده واکنش می دهد .
• اگر پروتئین آرژنین زیادی دارد، به استانداردی نیاز است که آرژنین زیادی داشته باشد .
• CBBG با این باقی‌مانده ها در فرم آنیونیک باند شده و جذب آن در 595nm خواهد بود .
• رنگ تنها با فرم کاتیونی می باشد و جذب آن در 470nm می باشد .
• ویژگیهای تست برادفورد (Bradford)
• ارزان و سریع
• بسیار ویژه برای پروتئین ها
• بسیار حساس [1-20 µg (micro assay) 20-200 µg (macro assay)]
• سازگار با طیف وسیعی از مواد
• واکنشگر کمپلکسی است که تقریباً یک ساعت پایدار می ماند .
• کرو استاندارد ، غیر خطی است .
• جوابگو برای پروتئین های گوناگون ، انتخاب استاندارد بسیار مهم است .
• طیف جذبی فرمهای آنیونی و کاتیونی بر روی هم می افتد .
• لذا کرو استاندارد خطی نیست ، اگر چه که تهیه کنندگان این کیت ها اصرار بر خطی بودن آن دارند .
• خطی بودن آن در پهنای غلظتی کوچکی است .
• اگر نمونه بیشتر از 20 µg باشد ، بهتر است از یک منحنی درجه دوم به جای یک خط راست استفاده شود .

منابع

Gornall, AG, CS Bardawill, and MM David. J. Biol. Chem. 177: 751. 1949.#

1. Layne, E. Spectrophotometric and Turbidimetric Methods for Measuring Proteins. Methods in Enzymology 10: 447-455. 1957.
2. Robinson, HW and CG Hogden. J. Biol. Chem. 135: 707. 1940.
3. Slater, RJ (ed.). Experiments in Molecular Biology. Clifton, New Jersey: Humana Press, 1986. P. 269.
4. Weichselbaum, TE. Am. J. Clin. Pathol. Suppl. 10: 40. 1946.

==